常規兔源多克隆抗體定制服務常規小鼠源多克隆抗體定制服務常規大鼠源多克隆抗體定制服務常規雞源多克隆抗體制備服務快速抗體制備服務多克隆抗體制備服務小鼠源單克隆抗體定制服務大鼠源單克隆抗體定制服務倉鼠源單克隆抗體定制服務兔子單克隆抗體制備雞單克隆抗體制備猴子單克隆抗體制備犬單克隆抗體制備單克隆抗體/雜交瘤細胞定制服務免疫組化保證性抗體制備轉錄后特殊修飾結構識別抗體制備抗專一亞型抗體制備配體模擬激活性抗體制備捕獲\報告配對抗體制備功能阻遏\專一型抗抗體制備特殊功能抗體制備服務膜蛋白抗體制備服務半抗原抗體制備服務脂質體免疫抗體制備服務自體抗原抗體制備服務特殊性質抗原抗體制備服務基于全細胞抗原呈遞的抗體制備方案基于傳統單克隆抗體制備方案G蛋白偶聯受體抗體制備服務抗離子通道蛋白抗體制備服務抗膜蛋白抗體制備專題噬菌體展示文庫構建工程化骨架蛋白文庫構建限制性多肽文庫構建噬菌體展示文庫篩選內化抗體篩選熱穩定性scFv/Fab篩選蛋白酶底物篩選單域抗體庫構建全人源單抗制備噬菌體展示和抗體文庫服務雙特異性納米抗體制備單域(納米)抗體庫構建納米抗體親和力成熟服務人源/人源化納米抗體制備DNA免疫技術制備膜蛋白納米抗體抗血腦屏障納米抗體制備納米抗體服務細菌展示服務核糖體展示服務酵母展示服務體外展示&其他服務酵母雙雜交篩選服務哺乳動物細胞雙雜交服務胞內抗體制備服務雙雜交服務原位雜交ISH熒光原位雜交FISH原位雜交服務X-射線晶體學通過肽庫方法通過LC-MS法通過三維電鏡方法基于生物信息學預測單克隆抗體表位作圖抗體測序服務表面等離子共振服務(SPR)等溫滴定量熱法服務(ITC)雙偏振極化干涉測量服務(DPI)差示掃描量熱法服務(DSC)免疫原性評價抗體親和力檢測抗體鑒定抗體分析服務二價和雙特異性scFv/Fab服務嵌合抗原受體(CAR)構建服務嵌合IgG構建scFV/Fab構建雙可變區免疫球蛋白制備服務定制半胱氨酸改型抗體超長CDR3s??固逯票?/a>非猴抗體的硅烷化抗體穩定性改進抗體親和力成熟抗體人源化服務抗體經典化服務人源抗體駱駝化服務人源抗體初始化服務抗體工程服務雙特異性T細胞銜接器(BiTE)Fab-scFv融合蛋白KNODBS-INTO-HOLE技術雜交瘤細胞系雙特異性抗體抗體和蛋白標記抗體生物素化Fab PEG化抗體偶聯藥物納米金標記抗體糖納米粒標記抗體標記服務酶和蛋白定向進化突變庫構建服務蛋白工程服務抗體人源化親和力成熟人源化牛超長CDR3抗體服務人源化納米抗體制備人源化猴單抗制備人源/人源化抗體服務蛋白/抗體偶聯服務生物素化服務寡聚糖生物偶聯寡核苷酸生物偶聯表面錨定服務脂質體偶聯服務PEG修飾服務合成聚合物修飾生物偶聯服務重組IgG制備scFv/Fab制備雙特異性抗體制備抗體和蛋白純化服務重組抗體制備服務穩定細胞系構建定制細胞裂解液穩定細胞系開發cGMP生產治療性抗體和蛋白生產大規模發酵服務cGMP生產大腸桿菌蛋白表達系統枯草芽孢桿菌表達系統酵母蛋白表達系統昆蟲桿狀病毒表達系統哺乳動物細胞蛋白表達系統富含二硫鍵蛋白的原核表達服務無細胞系統蛋白表達服務Marzf單一蛋白制備服務蛋白表達與純化服務抗體&多肽文庫重組抗體產品雜交瘤細胞系穩定細胞系CAR-T載體抗體定制服務平臺噬菌體展示平臺抗體藥物開發平臺CAR-T平臺蛋白表達與純化平臺大規模發酵服務平臺基因測序平臺
原位雜交ISH

原位雜交ISH

In Situ Hybridization (ISH)

  

原理簡介:

 原位雜交技術(in situhybridization)是以標記的核酸分子為探針,在組織細胞原位檢測特異核酸分子的技術。使含有特異序列、經過標記的核酸單鏈即探針,在適宜條件下與組織細胞中的互補核酸單鏈即靶核酸發生雜交,再以放射自顯影或免疫細胞化學方法對標記探針進行探測,從而在細胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。

可以檢測cRNA、miRNA、LnRNA、DNA??梢愿髦種質艫謀甌?,包括哺乳動物、爬行動物、菌、植物標本。也可以檢測組織芯片。

注:為了提高檢測的成功率,請在取材前跟公司業務員聯系,確認取材、固定、包埋要注意的事項。

樣品保存:
RNA 保存:

RNase 酶的存在使 RNA 保存變得困難。此酶廣泛存在于玻璃器皿上、試劑中以及操作人員身上及衣服上。RNase 可迅速破壞細胞中的 RNA 及 RNA 探針本身,因此用戶的實驗過程、手套和溶液需要保證無菌,防止探針或組織 RNA 受到 RNase 的污染。

冷凍切片的一般樣品保存:
為了使保存的載片獲得最佳結果,請勿將載片在室溫環境下干燥保存。正確方法是,將其置于 100% 乙醇中-20 °C 保存,或將其用莎倫包裝膜覆蓋的塑料盒在 -20 °C 或 -80 °C條件下保存。這種保存方法可使載片保存數年。


探針選擇:

RNA 探針:

RNA 探針長約 250–1500bp;長度為800bp左右的探針具有最佳靈敏度和特異性。轉錄模板應支持探針(反義鏈)和陰性對照(正義鏈)RNA 的轉錄。將轉錄模板克隆至包含對生啟動子的載體可實現這一目的。制備探針之前,必須對環狀模板進行線性化,但也可使用 PCR 模板。

DNA 探針:

DNA 探針為原位雜交提供較高的靈敏度。與RNA探針相比,DNA探針與靶mRNA 分子的雜交強度較弱,因此在雜交后的洗滌中不應使用甲醛。

探針特異性至關重要。如果已知細胞中mRNA或DNA的確切核苷酸序列,則可據此設計高度精確的互補探針。如果超過 5% 的堿基對不互補,那么探針只能與靶序列發生輕度雜交。這意味著,探針更容易在洗滌和檢測步驟中被洗去,可能無法正確檢測。


服務項目明細

價 格

服務項目明細

價 格

FISH

RNA水平

700元/張

CISH

RNA水平

700元/張

DNA水平

700元/張

DNA水平

700元/張

miRNA水平

700元/張

miRNA水平

700元/張

 

In Situ Hybridization (ISH); 原位雜交ISH



實驗方案舉例:
地高辛(DIG)標記RNA探針原位雜交實驗方案

此方案介紹了如何使用DIG標記的RNA單鏈探針來檢測石蠟包埋切片中目標基因的表達情況。

1) 脫蠟

如為冷凍切片請從第 2 步開始操作。

如為甲醛固定的石蠟包埋切片,請繼續此步驟。

首先,對載片進行脫蠟和復水操作。如果石蠟去除不完全,則會導致切片的染色效果較差。

將載片置于支架上,然后執行以下洗滌操作:

二甲苯:2x3 分鐘

1:1 的二甲苯和100%乙醇:3 分鐘

100%乙醇:2x3 分鐘

95%乙醇:3 分鐘

70%乙醇:3 分鐘

50%乙醇:3 分鐘

使用冰冷的自來水清洗

抗原修復步驟之前將載片置于自來水中。從這一步開始,不能使載片干燥,因為干燥會導致非特異性抗體結合和高背景染色。

2) 抗原修復

將含20 μg/mL蛋白酶K的50mM Tris預熱并在37 °C條件下孵育酶解10–20分鐘。孵育時間和蛋白酶 K 的濃度可能需要根據實際情況優化。

我們建議通過蛋白酶 K 滴定實驗來確定最佳條件。酶解不充分會導致雜交信號降低,過度酶解會影響組織形態,給雜交信號的定位帶來極大困難。蛋白酶 K 的最佳濃度會隨組織類型、固定時間和組織大小而發生變化。

3) 使用蒸餾水清洗載片5次。
4) 將載片浸入預冷的20% (v/v) 乙酸中20秒。這樣可使細胞通透化,使探針或抗體能夠透過。
5) 分別使用70%乙醇、95%乙醇和100%乙醇洗滌載片(每次約1分鐘)使其脫水,然后風干。
6) 向每個載片中加入 100 μL 雜交液。

試劑

終濃度

每 1 mL 溶液的使用量

甲酰胺

50%

500 μL

5x

250 μL

丹哈德溶液

5x

50 μL

硫酸葡聚糖

10%

100 μL

肝素

20 U/μL

10 μL

十二烷基硫酸鈉

0.1%

1 μL

鹽溶液 (20x)

4 M NaCl

100 mM EDTA

200 mM Tris-HCl pH 7.5

100 mM NaH2PO4.2H2O

100 mM NaH2PO4.2H2O

丹哈德溶液 (100x)

10 g聚蔗糖

10 g PVP(聚乙烯吡咯烷酮)

10 g 牛血清白蛋白 (BSA)

500 ml無菌 dH2O

7) 將載片置于所需雜交溫度下的增濕雜交盒中孵育1 小時。雜交溫度的范圍通常為 55–62 °C。
8) 在PCR 管中用雜交液稀釋探針。利用PCR儀在95 °C條件下加熱RNA 或DNA 2分鐘,使其變性。然后立即將探針置于冰上冷卻,以防止重退火。
9) 除去雜交液。向每個切片加入50–100μl探針稀釋液,覆蓋整個樣品。在 65 °C 條件下在增濕的雜交盒中孵育過夜。用蓋玻片蓋住樣品,以防樣品蒸發。

在此步驟中,RNA 探針會與相應的mRNA雜交,或DNA探針會與相應的細胞DNA雜交。雜交溫度的優化取決于所用的探針序列以及細胞或組織類型。所分析的每種組織類型都需進行雜交溫度的優化。

探針的最佳雜交溫度取決于靶序列中堿基的百分比含量。序列中胞嘧啶和鳥嘌呤的比例是關鍵因素。

10) 嚴格洗滌

通過調節溫度、鹽濃度和洗滌劑濃度等溶液參數可消除非特異性相互作用。

配制 1 L 20x 檸檬酸鈉緩沖液 (SSC)

175.3 g 氯化鈉 (3 M)

88.2 g 檸檬酸鈉

800 mL 無菌水

使用檸檬酸將 pH 調節為5,定容至1 L 并使用高壓滅菌器進行滅菌處理
洗滌 1

50% 甲酰胺的 2x SSC

3x5 分鐘,37-45 ℃

在較高溫度(高達 65° C)下短時間洗滌,洗去多余的探針和雜交緩沖液。如果洗滌時間過長,則會洗掉大量的雜交探針 RNA/DNA。

洗滌 2

  0.1–2x SSC

  3x5 分鐘,25-75 ℃

此步驟會消除非特異性和/或重復性 DNA/RNA 雜交。

按照以下說明對嚴謹洗滌的溫度和鹽濃度進行優化:

· 對于極短的DNA/RNA 探針 (0.5–3 kb) 或極為復雜的探針,洗滌溫度應更低(最高45 °C)且嚴格度更弱 (1–2xSSC)。

· 對于單基因座或較大的探針,溫度應在65 °C 左右且嚴格度應較強(低于0.5x SSC)。

· 對于重復性探針,溫度應達到最高且嚴格度應達到最強(例如 α-衛星重復序列)。

11) 在室溫下使用 MABT(含 Tween20 的馬來酸緩沖液)洗滌兩次,每次30分鐘。MABT 的性質比PBS 更溫和,更適用于核酸檢測。

配制 5x MABT 母液

   58 g 馬來酸

   43.5 g NaCl

   55 g Tween-20

   900 mL 水

添加三羥甲基氨基甲烷,將 pH 調節至 7.5。大約需要 100 g 三羥甲基氨基甲烷。定容至 1 L。

12) 烘干載片。
13) 將其轉移至增濕盒中,向每個切片加入 200 μL 封閉緩沖液(MABT + 2% BSA,牛奶或血清)。在室溫下封閉 1–2 小時。
14) 去除封閉緩沖液。將抗標記抗體以所需稀釋度加入封閉緩沖液。查看抗體說明書中推薦的濃度/稀釋度。在室溫下孵育 1–2 小時。
15) 在室溫下使用 MABT 洗滌載片 5 次,每次 10 分鐘。
16) 在室溫下使用預染色緩沖液(100 mM Tris pH9.5,100 mM NaCl,10 mM MgCl2)洗滌載片 2 次,每次 10 分鐘。
17) 如需進行熒光檢測,請跳至第 18 步。對于其他形式的檢測,請將載片放回增濕盒中,然后依照廠家說明書(如有說明書的話)使其顯色。

18) 使用蒸餾水清洗載片。
19) 將載片風干 30 分鐘。然后使用 100% 乙醇進行洗滌,并將其徹底風干。
20) 使用 DePeX 封片溶液進行封片。

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相關服務:

★ 原位雜交ISH

★ 熒光原位雜交FISH

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