常規兔源多克隆抗體定制服務常規小鼠源多克隆抗體定制服務常規大鼠源多克隆抗體定制服務常規雞源多克隆抗體制備服務快速抗體制備服務多克隆抗體制備服務小鼠源單克隆抗體定制服務大鼠源單克隆抗體定制服務倉鼠源單克隆抗體定制服務兔子單克隆抗體制備雞單克隆抗體制備猴子單克隆抗體制備犬單克隆抗體制備單克隆抗體/雜交瘤細胞定制服務免疫組化保證性抗體制備轉錄后特殊修飾結構識別抗體制備抗專一亞型抗體制備配體模擬激活性抗體制備捕獲\報告配對抗體制備功能阻遏\專一型抗抗體制備特殊功能抗體制備服務膜蛋白抗體制備服務半抗原抗體制備服務脂質體免疫抗體制備服務自體抗原抗體制備服務特殊性質抗原抗體制備服務基于全細胞抗原呈遞的抗體制備方案基于傳統單克隆抗體制備方案G蛋白偶聯受體抗體制備服務抗離子通道蛋白抗體制備服務抗膜蛋白抗體制備專題噬菌體展示文庫構建工程化骨架蛋白文庫構建限制性多肽文庫構建噬菌體展示文庫篩選內化抗體篩選熱穩定性scFv/Fab篩選蛋白酶底物篩選單域抗體庫構建全人源單抗制備噬菌體展示和抗體文庫服務雙特異性納米抗體制備單域(納米)抗體庫構建納米抗體親和力成熟服務人源/人源化納米抗體制備DNA免疫技術制備膜蛋白納米抗體抗血腦屏障納米抗體制備納米抗體服務細菌展示服務核糖體展示服務酵母展示服務體外展示&其他服務酵母雙雜交篩選服務哺乳動物細胞雙雜交服務胞內抗體制備服務雙雜交服務原位雜交ISH熒光原位雜交FISH原位雜交服務X-射線晶體學通過肽庫方法通過LC-MS法通過三維電鏡方法基于生物信息學預測單克隆抗體表位作圖抗體測序服務表面等離子共振服務(SPR)等溫滴定量熱法服務(ITC)雙偏振極化干涉測量服務(DPI)差示掃描量熱法服務(DSC)免疫原性評價抗體親和力檢測抗體鑒定抗體分析服務二價和雙特異性scFv/Fab服務嵌合抗原受體(CAR)構建服務嵌合IgG構建scFV/Fab構建雙可變區免疫球蛋白制備服務定制半胱氨酸改型抗體超長CDR3s??固逯票?/a>非猴抗體的硅烷化抗體穩定性改進抗體親和力成熟抗體人源化服務抗體經典化服務人源抗體駱駝化服務人源抗體初始化服務抗體工程服務雙特異性T細胞銜接器(BiTE)Fab-scFv融合蛋白KNODBS-INTO-HOLE技術雜交瘤細胞系雙特異性抗體抗體和蛋白標記抗體生物素化Fab PEG化抗體偶聯藥物納米金標記抗體糖納米粒標記抗體標記服務酶和蛋白定向進化突變庫構建服務蛋白工程服務抗體人源化人源化牛超長CDR3抗體服務人源化納米抗體制備人源化猴單抗制備人源/人源化抗體服務蛋白/抗體偶聯服務生物素化服務寡聚糖生物偶聯寡核苷酸生物偶聯表面錨定服務脂質體偶聯服務PEG修飾服務合成聚合物修飾生物偶聯服務重組IgG制備scFv/Fab制備雙特異性抗體制備抗體和蛋白純化服務重組抗體制備服務穩定細胞系構建定制細胞裂解液穩定細胞系開發cGMP生產治療性抗體和蛋白生產大規模發酵服務cGMP生產大腸桿菌蛋白表達系統枯草芽孢桿菌表達系統酵母蛋白表達系統昆蟲桿狀病毒表達系統哺乳動物細胞蛋白表達系統富含二硫鍵蛋白的原核表達服務無細胞系統蛋白表達服務Marzf單一蛋白制備服務蛋白表達與純化服務抗體&多肽文庫重組抗體產品雜交瘤細胞系穩定細胞系CAR-T載體抗體定制服務平臺噬菌體展示平臺抗體藥物開發平臺CAR-T平臺蛋白表達與純化平臺基因工程平臺
熒光原位雜交FISH

熒光原位雜交FISH

Fluorescent In Situ hybridization (FISH)

  熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH) 是將DNA (或RNA)探針用特殊的核苷酸分子標記,按照堿基互補的原則直接雜交結合到待檢測染色體或單鏈核酸上,形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。進行定性、定位、相對定量分析。

   FISH技術優勢:操作簡單、檢測快速、結果易觀察、可檢測多種類樣品、空間定位準確、靈敏性和特異性高

   FISH臨床意義:指導臨床治療及藥物選擇、疾病的分期分型及預后判斷、形態學檢測的輔助手段

熒光原位雜交(FISH)的實驗步驟

   FISH(Fluorescence In-Situ Hybridization)技術問世于20世紀70年代后期,是在原來的同位素原位雜交技術基礎上發展起來的。其基本原理是,按照兩個核酸的堿基序列互補原則,用特殊修飾的核苷酸分子標記DNA探針,然后將標記的探針直接原位雜交到染色體或DNA 纖維切片上,再與熒光素分子偶聯的單克隆抗體和探針分子特異性結合,經熒光檢測系統和圖形分析技術對染色體或DNA纖維上的DNA序列定位、定性和相對定量。

試驗方法如下:
1)玻片處理
(a)玻片清洗:熱肥皂水刷洗,1%鹽酸浸泡24h,再在0.1%焦炭酸二乙酯(DEPC)中浸泡24h。
(b)硅化處理:玻片和蓋玻片1%(質量分數)鹽酸煮沸10min,烘干,錫紙包好4℃保存備用。
(c)明膠涂片制備:將烘干的玻片放入明膠中10min,然后60℃烘干過夜備用。
(d)試劑瓶、塑料器皿及組織勻漿器的處理試劑瓶、組織勻漿器先清洗干凈,用1 mL/LDEPC (Diethyl Pyrocarbonate)水溶液浸泡處理(37℃、2h,室溫過夜),高壓消毒去除DEPC,然后250℃烘干4h以上或200℃過夜。稱量試劑勺也要干烤。塑料器皿最好用滅菌的一次性塑料用品,使用前進行高壓消毒,為保證質量,凡使用的槍頭、試管等均經0.5mL/L DEPC水溶液處理3h以上,然后再高壓滅菌,烘干。若為進口已處理的無RNase和DNase的槍頭、試管可不必處理直接使用。
(e)各種溶液的配制:凡是水溶性液體均用1mL/L DEPC水配制。
2)樣品制備及其所涉及的試劑包括:
(a)緩沖溶液
   1 X PBS緩沖溶液:NaCl 8g,Na2HPO4 2.9g,KCl 0.2g,KH2PO4 0.2g,溶入1000mL超純水;
   3 X PBS緩沖溶液:NaCl 24g,Na2HPO4 8.7g,KCl 0.6g,KH2PO4 0.6g,溶入1000mL超純水;
   通常配制成10 X PBS的儲備液,3 X PBS和1 X PBS可用DEPC水稀釋獲得。
(b)4%多聚甲醛(Paraformaldehyde, PFA)
   稱取2g PFA加入30ml約60℃的熱水,滴幾滴20% NaOH放在磁力攪拌器攪拌至完全溶解。然后向其中加入16.5ml 3 X PBS緩沖液,在冰浴中充分混勻冷卻,冷卻后,用HCl調整至中性(7.2左右),拿出攪拌子。向PFA溶液中加入超純水,定容在50ml。用0.45微米的膜過濾后使用。(室溫或4℃保存備用)。
注意:
   1、配制時應在通風條件下操作,并避免接觸皮膚和吸入(戴手套及口罩),因PFA有較強的固定作用及毒性,對粘膜及皮膚有固定及毒性,刺激作用;
   2、加熱時,溫度不宜過高,常為60~65℃,否則,PFA降解失效;
   3、配制好的PFA雖可存放一定時間,但過久的液體,固定效果下降,應盡早使用。
   4% PFA是目前原位雜交組織化學技術中最常用的固定液,它能較好地保持組織及細胞內的RNA,同時對形態保持也較好。樣品固定時間在2~3小時,RNA含量較為恒定。過度延長固定時間會引起細胞內生物大分子的過度交聯,影響探針的穿透力,降低雜交效率。
(c)配制50%,80%,98%無水乙醇溶液,每個總量20mL。
(d)DAPI溶液
   用1ml ddH2O將DAPI溶解,制得2.9 mM的DAPI溶液(1mgDAPI/1mL H2O)。(DAPI不能直接用PBS等緩沖液溶解,需要先用水將其溶解)。取適量DAPI水溶液加到PBS中,制備成10~50 uM的DAPI溶液。
3)取樣及保存方法
(a)反應器沉淀前取樣2~5mL至離心管。
(b)離心(2000r/min)5min,去上清液(加蒸餾水重復兩次)。
(c)樣品加入1mL多聚甲醛,搖勻,4℃下放置3h。
(d)樣品離心(12000r/min)5min,去上清夜。
(e)加入1X PBS,搖勻,離心(10000r/min)5min,去上清夜(重復3次)。
(f)加0.5mL 1X PBS,0.5mL無水乙醇,搖勻,-20℃保存(可保存6個月)。
4)樣品固定:
   稀釋樣品3~5倍,對樣品進行超聲處理(3W超聲2~3min,沉降1min,去沉淀物,5W超聲5min),將活性污泥絮體打散成單個細胞以便于顯微鏡計數。然后取3μL樣品涂于包埋明膠的玻片上(檢查樣片本底),37℃的熱烘箱固定2h(或者在空氣中干燥2h或者過夜)。依次用50%、80%、98%(質量比)乙醇浸漬3min,對細胞進行脫水后,立放,并進行干燥。
5)樣品雜交
   試驗所涉及的緩沖液包括雜交緩沖液(HybridizationBuffer, HB)和淋洗緩沖液(Washing Buffer, WB),其組分如表1-1和表1-2。
表1-1 雜交緩沖液(Hybridization Buffer)



5%

10%

20%

30%

35%

40%

0.05%SDS(uL)

1.2

1.2

1.2

1.2

1.2

1.2

50mMTri-HCl(uL)

24

24

24

24

24

24

5mol  NaCl(mL)

4.32

4.32

4.32

4.32

4.32

4.32

甲酰胺(mL)

1.2

2.4

4.8

7.2

8.4

9.6

蒸餾水(mL)

18.4548

17.2548

14.8548

12.4548

11.2548

10.0548

探針

Nsm156

Ntcoc206

Ntspn693

Nsv443

Ntspa662  NSO1225 Nmv

NIT3

表1-2淋洗緩沖液(Washing Buffer)

組分

體積

0.05%SDS

0.6 uL

50mM Tri-HCl

12 uL

5mol  NaCl

2.16mL

蒸餾水

42.8274mL

(a)吸取2mL雜交緩沖液遍布在雜交盒內折好的吸水紙上,將已固定好樣品的載玻片放入雜交管中,然后在46℃雜交爐中放置數分鐘。
(b)吸取10 uL探針貯存液和80 uL雜交緩沖液混合后,用箔紙包好放入46℃雜交爐中
預熱數分鐘;探針貯存液濃度為25ng/uL,用無菌水稀釋購買的探針,實驗用的探針序列及雜交條件見表1-3所示。
表1-3 用于檢測樣品中AOX、NOX的寡核苷酸探針及雜交條件

探針

探針序列

標記細菌種屬

濃度a


NSO1225

CGCCATTGTATTACGTGTGA

Ammonia oxidizing  beta-proteobacteria

35


Nsv443

CCGTGACCGTTTCGTTCCG

Nitroso-spira,  -lobus, -vibrio

30


Nmv

TCCTCAGAGACTACGCGG

Nitroso-coccus

35


Ntspa662

GGAATTCCGCGCTCCTCT

Nitrospira

35


NIT3

CCTGGCTCCATGCTCCG

Nitrobacter

40


Ntcoc206

CGGTGCGAGCTTGCAAGC

Nitrococcus  mobilis

10


Ntspn693

TTCCCAATATCAACGCATT

Nitrospina  gracilis

20


注:
(a) 表示雜交緩沖液中去離子甲酰胺濃度(%)
(c)吸取9uL預熱后的探針稀釋液涂于載玻片待測樣品上,然后將載玻片迅速地移回雜交管中于46℃下進行雜交(黑暗中進行),雜交時間為2~3h;
(d)雜交后的洗脫:打開恒溫水浴槽,加熱到48℃,對雜交緩沖液、淋洗緩沖液進行預熱。雜交盒中取出載玻片用雜交緩沖液沖洗樣品后,快速放入淋洗緩沖液,48℃水浴20min后用4℃冰水,沖洗樣品,樣品潔凈臺中揮干。
DAPI染色
   每孔滴9uLDAPI,4℃暗處5min,4℃冰水(BPS緩沖溶液)沖洗,揮干。用帶有360 nm激發波長,460nm發射波長的濾光片的熒光顯微鏡觀察細胞。DAPI(4,6-diamido-2-phenylindole)染色用于全細胞計數。
封片
   涂封片劑,蓋蓋玻片,無氣泡后指甲油封裝。
熒光顯微鏡進行檢測
   每個樣品及每個探針都采集20個不同區域。每個區域中的細胞個數要超過1000個,然后進行平均以獲得每個探針對于每個樣品的雜交結果。細菌豐度或細菌數目(cells/g或cells/L)為AS1/(S2V),其中A為視野中細菌平均數;S1為樣品涂抹面積;S2為視野涂抹面積;V為樣品體積。

原位雜交服務

相關服務:

★ 原位雜交ISH

★ 熒光原位雜交FISH

技術平臺:

 抗體定制服務平臺


在線咨詢
 工作時間
周一至周五 :8:30-22:30
周六至周日 :9:00-18:00
 聯系方式
客服熱線:400-965-8633
固定電話:010-56256916
郵箱:[email protected]

艾柏森(北京)生物科技有限公司

關于我們我們的服務我們的產品新聞動態

關于我們

抗體開發

噬菌體展示文庫

合作伙伴

技術平臺抗體工程多肽文庫官方微信
新聞動態
GMP生產雜交瘤細胞株留言板
聯系我們
蛋白表達與制備重組抗體友情鏈接


聯系我們

地址:北京經濟技術開發區科創十四街

99號7幢1單元4層

客服QQ:3536562335
電話:010-57263834
郵箱:[email protected]